Humanes neuronales Zellmaterial wird für die regenerative Medizin sowie physiologische und pharmakologische Studien dringend benötigt, ist aber sehr eingeschränkt verfügbar. Es wurden deshalb bereits verschiedene Ansätze entwickelt, neuronale Zellen aus gut zugänglichen und in vitro vermehrbaren Zellen zu transdifferenzieren und damit ein neuronales Zellmodell zu kreieren. Für ein aussagekräftiges Zellmodell ist es allerdings notwendig, die generierten Zellen, wie auch das Ausgangszellmaterial, exakt zu kennen und den neuronalen Entwicklungsstand nach der Differenzierung möglichst präzise einordnen zu können.
Sowohl Ionenkanäle als auch Gap Junctions sind für die Integration, Funktion und Entwicklung von Zellen in ein Gewebe essenziell, da sie die inter- und intrazelluläre Signalgebung und somit auch die Zellkommunikation sowie Differenzierung maßgeblich beeinflussen, so auch in neuronalem Gewebe. Ziel dieser Dissertation war deshalb die Untersuchung der Regulation von Ionenkanälen und Gap Junctions während der Zellentwicklung am in vitro-Modell neuronal transdifferenzierter humaner MSCs aus dem Knochenmark.
Die unbehandelten MSCs exprimierten die charakteristischen MSC-Marker CD73, CD90, CD105 und CD166 wie auch den neuronalen Marker Tuj1. Während der neuronalen small molecule-induzierten Transdifferenzierungen wurden die MSC-Marker signifikant herunterreguliert und die Expression von Tuj1 gesteigert. Die neuronal transdifferenzierten Zellen entwickelten zudem eine elektrische Erregbarkeit und konnten einzelne Aktionspotentiale erzeugen. In den MSCs und den neuronal differenzierten Zellen konnten verschiedene Isoformen der Gap Junction-bildenden Connexine nachgewiesen werden, wobei sich das Expressionsmuster durch die Differenzierung veränderte. Die in den MSCs starke Gap Junction-vermittelte Zellkopplung war in den transdifferenzierten Zellen fast vollständig unterdrückt, wobei die Aktivität von Gap Junction-Halbkanälen gesteigert war. Bei einer extrazellulären Zugabe des Neurotransmitters ATP reagierten sowohl die MSCs als auch die induzierten neuronalen Zellen mit intrazellulären Ca2+-Signalen, wobei die Reaktionsfähigkeit der MSCs dabei insgesamt höher war. Das Ca2+-Signal in den MSCs wurde vor allem durch die metabotropen P2Y-Rezeptoren und geringfügig durch die ionotropen P2X-Rezeptoren determiniert. Die Aktivität der P2Y-Rezeptoren wurde durch die neuronale Transdifferenzierung deutlich verringert.
Die Analyse verschiedener Marker und die physiologische Charakterisierung der neuronal induzierten Zellen ließen auf eine induzierte Entwicklung unreifer Neuronen oder neuronaler Stamm-oder Vorläuferzellen schließen, die für die Verwendung als neuronales Zellmodell durchaus vielversprechend sind.
Human neuronal cell material is highly needed for regenerative medicine as well as for physiological and pharmacological studies but has a very limited availability. Different approaches have been developed to transdifferentiate well-accessible and in vitro expandable cells into neuronal cells, thereby creating a neuronal cell model. To establish a sophisticated model it is imperative to know the evolved as well as the initial cells in detail and to be able to precisely assess the neuronal developmental state after differentiation.
Ion channels as well as gap junctions are essential for integration, function and development of cells in tissue, as they strongly influence the inter- and intracellular signalling. Thus, they affect cell communication and differentiation as well, also in neuronal tissue. The aim of this dissertation was to examine the regulation of ion channels and gap junctions during cell development on the in vitro model of neuronal transdifferentiated bone marrow-derived mesenchymal stem/stromal cells (MSCs).
Untreated MSCs express the characteristic MSC markers CD73, CD90, CD105 and CD166 as well as the neuronal marker Tuj1. During small molecule-induced neuronal transdifferentiation the MSC markers were significantly down-regulated while Tuj1 was up-regulated. The neuronal transdifferentiated cells developed an electrical excitability and were able to evoke single action potentials. In MSCs as well as in the differentiated cells different isoforms of the gap junction-building connexins could be detected, whereby the expression pattern changed during differentiation. The strong gap junction coupling of the MSCs was nearly completely suppressed in the transdifferentiated cells whereas these cells showed an enhanced gap junction hemichannel activity. Upon extracellular stimulation with the neurotransmitter ATP the MSCs as well as the induced neuronal cells reacted by provoking intracellular Ca2+ signals. In MSCs, the response capacity was higher than in the neuronal cells and the Ca2+ signal was mainly determined by metabotropic P2Y-receptors and only slightly by ionotropic P2X-receptors. The activity of the P2Y-receptors was significantly reduced during neuronal transdifferentiation of the MSCs.
Analysing different markers and physiologically characterising the neuronal induced cells leads to the conclusion that immature neurons or neuronal stem and progenitor cells have been developed, which appear promising concerning their use as a neuronal cell model.
