Identifizierung und Charakterisierung neuartiger α-Amylasen aus Basidiomycota für die Waschmittelindustrie

Abstract

Der Einsatz von Enzymen in Waschmittelformulierungen steigt seit Jahrzehnten beständig an. Zu den am meist verwendeten Enzymen gehören die α-Amylasen, wobei deren bakterieller Ursprung überwiegt. Zudem sind Pilze in der Lage eine Vielfalt an extrazellulären Enzymen zu bilden, um sich ihren Lebensraum zu erschließen. In der vorliegenden Arbeit wurden neuartige pilzliche α-Amylasen für den Einsatz in Waschmittelformulierungen gesucht. Insgesamt wurden dabei über 50 verschiedene Basidiomycota kultiviert und deren Sekretom nach waschaktiven α-Amylasen gescreent. Dafür wurden sowohl Aktivitätsassays als auch Applikationsstudien durchgeführt. Es stellte sich heraus, dass mit Rhizoctonia solani, Trametes hirsuta, Irpex lacteus, Fomes fomentarius, Fomitopsis pinicola, Pleurotus sajor-caju, Pycnoporus sanguineus und Lentinus strygosus acht Stämme α-Amylasen mit einer verbesserten Waschleistung produzierten. Es gelang dabei nach einer Reinigung mittels IEX und anschließender Analyse mittels SDS-PAGE sowie Zymografien, die waschaktiven Enzyme zu separieren und mittels Massenspektrometrie zu identifizieren. Anhand der durchgeführten de-novo Sequenzierung konnten die α-Amylasen von R. solani, T. hirsuta, I. lacteus, F. fomentarius, F. pinicola, und P. sanguineus identifiziert werden. Ausgehend von den korrespondierenden Genomdaten wurden Primer abgeleitet und schließlich die codierenden Gene amplifiziert. Bei einem Vergleich der α-Amylasen zeigte sich, dass Amylasen mit einer Stärke bindenden Domäne, der CBM20, die besten Waschleistungen im isoaktiven Vergleich erzielten. Von sechs identifizierten α-Amylasen weisen R. solani, T. hirsuta, F. fomentarius und F. pinicola diese Domäne auf, was verglichen mit der natürlichen Auftrittswahrscheinlichkeit von zehn Prozent eine Anhäufung zeigt. Der Versuch einige ausgewählte α-Amylase-Gene in Komagataella phaffii zu exprimieren, führte nicht zum gewünschten Erfolg, auch nicht mit Hilfe von molekularbiologischen Varianten, wie der Anpassung der codon usage, der Änderung der Signalsequenzen oder der Produktion als Fusionsprotein. Daher sollte mit Aspergillus oryzae ein neuer Expressionsstamm designt werden, bei welchem mittels der CRISPR-Technik die wirtseigenen Amylasen ausgeknockt werden sollten. Nach der Sequenzierung der Genombereiche, stellte sich heraus, dass es zu keinen CRISPR vermittelten Deletionen im Bereich der Zielgene gekommen war.