Heterologe Produktion basidiomycetischer Peptidasen zur Reduktion von Speisesalz in Lebensmitteln

Abstract

In der Vergangenheit rückte das Thema eines überhöhten Salzkonsums und damit einhergehend verschiedener chronischer Erkrankungen in den Fokus der Wissenschaft. Enzyme wie Hydrolasen und speziell Peptidasen werden bereits industriell eingesetzt, da sie keine Cofaktoren benötigen, oft bei hohen pH-Werten stabil sind und eine breite Spaltspezifität haben. Eine neue Anwendung von Peptidasen könnte die Generierung von L-Arginyl-dipeptiden sein. Diese Dipeptide haben keinen Eigengeschmack, sind aber in der Lage, den vorhandenen Salzgeschmack zu intensivieren. Um diese Dipeptide zu generieren, sollten in der vorliegenden Arbeit arginylspezifische Peptidasen aus Basidiomyceten isoliert und identifiziert werden. Zunächst wurden verschiedene Peptidasegene aus Trametes versicolor, Phanerochaete chrysosporium und Schizophyllum commune isoliert und in Escherichia coli bzw. Komagataella phaffii exprimiert. Eine Serinpeptidase (ABB73029) aus P. chrysosporium sowie eine Aspartatpeptidase aus T. versicolor (EIW62808) wurden erfolgreich gereinigt. Aktivitätsassays zeigten, dass es sich bei der Aspartatpeptidase nicht um eine arginylspezifische Peptidase handelt, während die Schnittstellenanalyse für die Serinpeptidase aus P. chrysosporium auf eine Exopeptidase hindeutet. In einem zweiten Ansatz wurden 29 Basidiomyceten in Minimalmedium mit 1 % Gluten über einen Zeitraum von 24 Tagen kultiviert und hinsichtlich ihrer Endo- und Exopeptidaseaktivität untersucht. Von den 29 Pilzen wurden insgesamt fünf interessante Spezies mit arginylspezifischer Peptidaseaktivität ausgewählt, darunter Agrocybe aegerita, Fomitopsis pinicola, Flammulina velutipes, Hypholoma sublateritium und Pleurotus eryngii. Nach Reinigung des Kulturüberstandes mittels Größenausschlusschromatographie, wurden aktive Fraktionen mit dem Substrat Casein inkubiert und die Spaltprodukte analysiert. Nur für Peptidasen aus A. aegerita, F. velutipes und P. eryngii wurden Schnittstellen detektiert. Da neben arginylspezifischen Schnittstellen auch ein hoher Anteil unerwünschter Exo-peptidaseschnittstellen ermittelt wurde, handelt es sich bei den Enzymen vermutlich um Exopeptidasen anstatt arginylspezifische Peptidasen. Die Generierung salzgeschmackverstärkender Dipeptide sollte final mit Hilfe einer Dipeptidylpeptidase V (DPPV) aus Pleurotus floridanus erfolgen. PflDPPV wurde heterolog in E. coli produziert und zeigte Optima bei pH 8,5 und 60 °C gegenüber dem Substrat H-L-Ala-L-Ala-para-Nitroanilin. Zudem wurde die Aktivität durch keinen Peptidaseinhibitor vollständig inhibiert.