Neue Aufarbeitungsstrategien für biologisch aktive Proteine am Beispiel des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors

Abstract

Heparin wird als biospezifischer Ligand zur Proteinaufreinigung in der Biotechnolo-gie verwendet. Dieses Verfahren ist bei vielen Heparin-bindenden Proteinen sehr ergiebig. Heparin wird allerdings aus Schlachtabfällen von Schweinen gewonnen und birgt die Gefahr der Kontamination mit tierischen Pathogenen. Die aufgereinigten Proteine könnten aufgrund dessen ebenfalls kontaminiert sein, weshalb nach adäquaten Alternativen sowohl in der Biotechnologie als auch in der Pharmaindustrie geforscht wird. Im Rahmen dieser Dissertation wurden verschiedene Materialien mit synthetischen Liganden für die Aufreinigung des Modellproteins, dem basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF), untersucht. Die verwendeten Aufreinigungsmethoden konnten der Mixed-Mode-Chromatographie (MMC) und pseudo-Affinitätschromatographie zugeordnet werden. Bei der MMC werden Materialien mit multimodalen Liganden eingesetzt, welche aufgrund ihrer molekularen Zusammen-setzung unterschiedliche Wechselwirkungen zum Analyten ausbilden können (ioni-sche Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Van-der-Waals-Wechselwirkungen), traditionelle Chromatographien beruhen auf nur einer Art von Wechselwirkungen. Materialien bei der pseudo-Affinitätschromatographie besitzen pseudo-biospezifische Liganden, die synthetisch hergestellt werden. Bei den verwendeten Liganden handelte es sich um Heparin-ähnliche Moleküle, die auf der molekularen Struktur des Heparins basierten. Es wurden acht multimodale und pseudo-biospezifische Materialien für die Aufreini-gung des bFGF eingesetzt und im Capture-Schritt sowie im intermediären Aufreini-gungsschritt in einer mehrstufigen Aufreinigung des bFGF getestet. Die Materialien-wurden hinsichtlich Reinheit, Wiederfindungsrate und Ausbeute des bFGF bewertet. Durch die Verwendung der multimodalen Materialien HiTrapTM CaptoTM MMC und ForesightTM NuviaTM cPrimeTM konnten zwei wirksame Alternativen ohne tierische Komponenten zur Aufreinigung des bioaktiven bFGF demonstriert werden.

Heparin is known for its therapeutic benefits in the treatment and prevention of thrombosis. It is also used in the biotech industry as a bio-specific ligand for protein purification. Heparin affinity chromatography is very efficient for the purification of various heparin-binding proteins. However, heparin is isolated from porcine intestines and entails the risk of contamination with animal pathogens. As a consequence, the purified proteins could also be contaminated. Therefore, both the biotech and the pharmaceutical industry are looking for an adequate alternative to heparin affinity chromatography. This dissertation outlines various materials with synthetic ligands for heparin-free purification. Basic fibroblast growth factor (bFGF) was used as a model protein. The alternative ligands used in this work could be assigned to mixed-mode chromatog-raphy (MMC) and pseudo-affinity chromatography. Due to the molecular composi-tion of their ligands, MMCs can undergo different interactions with the analyte (ion-ic interactions, hydrogen bonds, Van-der-Waals interactions), in contrast to tradi-tional chromatography, which typically uses only one kind of interaction. Pseudo-affinity chromatography supports pseudo-specific ligands which are synthetically produced. In this case, heparin-like molecules based on heparin’s molecular structure were tested as ligands. Eight multimodal and pseudo-biospecific materials were used in the capture step and in the second purification step for the purification of bFGF. They were compared to one another by evaluating purity, recovery, and yield of bFGF after purification. Two of the tested synthetic phases – the MMC HiTrapTM CaptoTM MMC and Fore-sightTM NuviaTM cPrimeTM – were demonstrated to be effective animal-component free alternatives for the purification of bioactive bFGF.